Estimação das componentes da variância fenotípica

Tal como o conhecimento de um genótipo ou conjunto de genótipos leva a prever as características da descendência em variação descontínua, em variação contínua o que permite prever eventuais progressos da selecção é a informação sobre os valores melhoradores presentes na população, e que se resume numa heritabilidade para essa característica nessa população. Os valores de heritabilidade não são gerais para a espécie, isto é, um valor previamente obtido para certos stocks da mesma espécie pode não representar nada para a população de base em que se pretende efectuar o melhoramento; assim, é importante tentar obter estimativas da heritabilidade para cada caso: o valor numérico da heritabilidade constitui um factor de decisão que define para o melhorador os resultados a esperar de um determinado procedimento — com base nessa previsão, é-lhe possível avaliar os custos e vantagens de seleccionar dentro da população em causa.

É claro que as estimativas de heritabilidade, qualquer que seja o método a que se recorre, requerem grandes amostragens e as condições experimentais têm de ser muito bem controladas; além disso, as estratégias utilizadas podem variar substancialmente — segundo o objectivo em vista para o melhoramento, a biologia da espécie com que se trabalha (especialmente em função do seu modo de reprodução e do tempo de maturação), e o dispor-se ou não de linhas puras. É por isso necessário conhecer profundamente não só a população com que se trabalha, como os objectivos de selecção propostos.

Os postulados de base

A população ou populações disponíveis à partida podem estar ou não suficientemente próximo das frequências genotípicas de equilíbrio. Eventuais desvios são detectáveis através da determinação dos desequilíbrios gaméticos e dos coeficientes de consanguinidade em diversos loci marcadores; de preferência, esses marcadores devem ser codominantes e representarem a maioria dos grupos de ligação. O apoio em fenótipos moleculares (por exemplo isoenzimas ou sequências de DNA) é da maior importância para tais determinações. Caso tais desvios sejam significativos, é de elementar bom-senso tentar constituir-se uma população em equilíbrio, através da polinização ao acaso entre indivíduos da geração anterior (uma amostra na medida do possível representativa de toda a variabilidade genética da população, ou seja, cuidando de obter um N_e de valor elevado), e iniciar a análise da variância fenotípica a partir desta população "sintética".

As plantas autogâmicas formam um caso àparte. Cada população tem provavelmente valores de F muito elevados, podendo até ser virtualmente isogénica; sendo em regra difícil produzir uma população em equilíbrio por polinização cruzada, o ponto de partida são linhas puras donde se produzem populações F₁ com as quais se faz uma análise por selfings e backcrosses. Em cada uma destas famílias sabe-se que em princípio há apenas dois alelos por locus e com a mesma frequência até à F₂. Além disso, a F₂ obtida por selfing na F₁ é em princípio uma boa aproximação "sintética" da ideal para o equilíbrio de Hardy-Weinberg, como é definida no parágrafo anterior. Inversamente, a opção de partir de linhas puras poderá até, com adaptações, estender-se a plantas alogâmicas.

Nem todos os fenótipos têm distribuição normal, e nesses casos o rigor das previsões pode ser muito deficiente; há contudo a possibilidade de produzir distribuições normais através da transformação matemática da variável em estudo. Por exemplo, considerando uma taxa de crescimento que é calculada a partir de medições regulares, com um intervalo de tempo T constante: supondo que a taxa medida é uma função de T^P, e P um fenótipo não observável directamente mas determinante do crescimento e com distribuição normal, a distribuição dessa taxa de crescimento será assimétrica; mas aplicando logaritmos aos valores observados, reconstitui-se uma distribuição normal, porque a variável logarítmica é função linear de P: log(T^P) = P×log(T). Por outras palavras, a distribuição fenotípica original mascara as verdadeiras propriedades da variação dos valores genotípicos, e a transformação de escala procura torná-las aparentes. Este procedimento é perfeitamente legítimo para a análise genética, porque o que está em causa é estudar a variação; as decisões que se tomar hão-de recair sobre indivíduos, identificados através dos seus valores na escala fenotípica que se achou mais adequada. A escala em si mesma é secundária, até porque nunca se altera o ordenamento dos indivíduos pelos respectivos fenótipos.

A transformação logarítmica é talvez a mais simples e frequentemente utilizada em fenótipos com interesse económico, mas é natural que outras (quadráticas, trigonométricas, etc.) sejam necessárias consoante os casos. Há situações ainda em que a distribuição parece ser simétrica e normal, mas não o é de facto (uma causa comum para essa ilusão resulta de a margem de variação observada não ser suficientemente grande). Existem testes de escala (cf. livro de Mather & Jinks), baseados nas previsões segundo a teoria poligénica para as médias das sucessivas gerações (especialmente em cruzamentos a partir de linhas puras até à F₂ pelo menos, e diversos tipos de backcross), que permitem verificar se a escala com que se trabalha é a mais correcta.

As componentes ambientais

O "ambiente" influencia a variação fenotípica interferindo, positiva ou negativamente, na manifestação dos genes (parcela E do fenótipo P): por mais controladas que sejam as condições de crescimento, há sempre flutuações incontroláveis na utilização da luz, água, nutrição, etc., tanto entre indivíduos como dentro do mesmo indivíduo. Estando sempre presente este factor, cada programa de melhoramento deveria levar em conta as condições reais de maneio futuro das variedades a obter, pelo que o ideal seria estudar a variação fenotípica entre solos, entre temperaturas, entre estações do ano, com ou sem protecção contra pragas, etc..

Isto, entre outras razões, porque os diferentes genótipos podem exibir diferentes susceptibilidades a essas flutuações e originar falsas expectativas de expressão fenotípica. Esta componente adicional da variação fenotípica é a covariância genótipo-ambiente, representada por COV_GE de acordo com o seguinte desenvolvimento:

P = G + E ⇒ V_P = V_G + V_E + 2COV_GE

O exemplo mais flagrante desta situação tem a ver com a dualidade entre heterose e depressão de consanguinidade: como referido no capítulo anterior, uma das qualidades de muitos híbridos de linhas puras é uma relativamente reduzida dispersão de valores fenotípicos (por exemplo maior sincronização da floração, maior uniformidade do crescimento, etc.), quando em comparação com os seus progenitores. Se bem que em tais populações, homogéneas genotipicamente, não haja covariância, este tipo de situação indica que, na F₂ ou noutras populações heterogéneas, a COV_GE será negativa.

A principal consequência deste efeito da consanguinidade é a seguinte: quanto maior vai sendo a pressão selectiva acumulada numa determinada direcção, maior é a proporção de loci fixados, isto é, maior é o grau de homozigose de todos os indivíduos seleccionados; as gerações obtidas, mesmo que tenham valores médios melhores, têm uma tal dispersão fenotípica que acabam por ter menos interesse comercial do que variedades mais uniformes, mesmo que com valores médios menos bons. Também por isso muitos programas de melhoramento são orientados para a optimização da heterose em híbridos e não para a selecção.

A covariância genótipo-ambiente é provavelmente uma componente sempre presente na variância fenotípica, mas a sua dimensão real precisa de ser avaliada por procedimentos exigentes experimentalmente, nem sempre aplicáveis a todas as espécies (por exemplo, fazendo ANOVA bifactorial (genótipos × ambientes) com réplicas).

Certos designs experimentais permitem separar duas componentes da V_E: dentro de famílias (E₁) e entre famílias (E₂). Trata-se de situações em que as sementeiras são feitas por grupos descendentes de cada genótipo, indivíduo, ou flor. Cada talhão "familiar" tem por isso um ambiente comum que pode ou não ser diferente dos ambientes dos restantes grupos (por exemplo diferenças na qualidade do solo, na rega, ou na exposição à luz). A E₂ é por isso a variância resultante dessas diferenças de ambiente comum duns grupos para os outros, e pode ser calculada por ANOVA. A E₁ é o resíduo estatístico da componente ambiental da variância fenotípica, e refere-se às influências ambientais não atribuíveis a uma componente identificável, e que existem sempre em maior ou menor grau. É caso para dizer-se que a heritabilidade 1 é apenas uma possibilidade teórica.

Onde seja possível distribuir as sementes ao acaso (desde que posteriormente se possam identificar todas as plantas), pode testar-se se a variância entre talhões é significativamente diferente de 0. Se não o for, então postula-se E₂ = 0, sendo assim toda a variância ambiental apenas do tipo E₁.

A complexidade das influências ambientais implica uma certa precaução na interpretação dos resultados das experiências com clones, linhas puras ou gerações homogéneas F₁. Em princípio, como a variância fenotípica dentro de uma população destas é exclusivamente ambiental, ela poderia ser usada como estimativa da E₁, para tal tendo de demonstrar-se que, para a população onde se pretende fazer o melhoramento, a COV_GE é nula. Caso não o seja, a V_P medida pode variar significativamente de genótipo para genótipo, e também variar entre diferentes talhões com o mesmo genótipo. Isto pode dever-se tanto a diferenças de canalização do fenótipo como a efeitos maternos, estes confundindo-se com a componente genotípica se não houver maneira de os quantificar separadamente.

Não obstante, este tipo de determinações pode revelar-se de grande utilidade, não só para demonstrar ou não uma COV_GE e assim avaliar até que ponto (isto é, com que erro) se conseguem fazer estimativas independentes das variâncias ambientais, em paralelo aos designs ANOVA, regressões ou respostas à selecção, como para conhecer o comportamento de cada genótipo face às flutuações do ambiente.

Linhas puras

A análise a partir de linhas puras aplica-se principalmente a plantas autogâmicas, pela relativa facilidade em tornarem-se isogénicas e pelas relativas dificuldades de manipulação para cruzamentos. Mas também se aplica a outras situações que, mesmo não partindo formalmente de linhas puras, se podem considerar análogas:

i) aos cruzamentos interespecíficos, especialmente se se supõe haver consanguinidade dentro de cada uma das espécies, porque são quase como cruzamentos entre linhas puras — devido à diferença entre espécies, comparada com a variação genotípica dentro de cada população que participou no cruzamento inicial, a da F₂ é muitíssimo superior;

ii) nas espécies onde a polinização cruzada ocorre normalmente, mas que também efectuam selfing (por exemplo no milho), pode considerar-se cada indivíduo retirado de uma população como uma F₁ entre progenitores incógnitos; do selfing de cada indivíduo obtêm-se gerações "F₂", as quais poderão analisar-se — tanto melhor quanto mais indivíduos "F₁" se utilizam à partida — seja por selfing (famílias F₃ e na correlação dos seus valores médios com os progenitores da F₂) ou por BiPs. Adiante esses procedimentos serão descritos.

Partindo de linhas puras, dispõe-se de um sofisticado leque de opções (cf. o livro de Mather & Jinks), das quais apenas irá fazer-se o estudo da mais simples.

A variância fenotípica da F₂ é dada por V_A + V_D + E₁. Mas para poder separar as diversas componentes é necessário ter uma estimativa da E₁, e recorrer a backcrosses com a F₁:

Independentemente de fazer-se uma estimativa da E₁, tem-se

Substituindo o valor de (V_D + E₁) na equação de V_P(F₂) obtém-se V_A.

Para calcular V_D terá de assumir-se um valor para E₁, o que é bastante simples se for comum a todos os genótipos (COV_GE = 0), constante entre gerações, e a E₂ for nula (cf. "ambiente entre famílias"). Em relação ao primeiro postulado (de COV_GE nula) há duas vias independentes de verificação: a comparação entre as variâncias fenotípicas nas duas linhas puras iniciais e no respectivo híbrido F₁, pois todas são exclusivamente ambientais mas em três genótipos muito diferentes — é um postulado que implica uma variância fenotípica igual entre os três; ou a comparação entre os backcrosses, também com expectativa de variância fenotípica igual. Se tal não se verificar, e quando a V_P(F₁) é inferior à das linhas puras, pode presumir-se que há heterose na F₁ (cf. "depressão de consanguinidade"), e nessa situação é válido adoptar-se a média ponderada das três variâncias fenotípicas: E₁ = [V_P(P₁) + V_P(P₂) + 2V_P(F₁)]/4. Se, por outro lado, se verificar que as variâncias são tanto mais elevadas quanto maiores são as médias, é possível que uma transformação da escala dos dados (designadamente logarítmica) seja suficiente para corrigir a heterogeneidade.

Em relação ao segundo postulado (E₁ constante entre gerações), é necessária a sementeira das linhas parentais em cada geração, esperando-se que as suas variâncias fenotípicas se mantenham constantes (aliás, também permite fazer um controlo de eventuais desvios das médias devido a flutuações ambientais, o que não sendo importante no que respeita ao estudo das variâncias tem obviamente um grande interesse para compreender o comportamento do fenótipo em geral e previsão das margens de erro nas respostas a obter).

Designs ANOVA

A ANOVA (Analysis of Variance) permite fazer estimativas das diferentes componentes da variância fenotípica. Essas componentes são deduzidas em função dos parentescos que relacionam os indivíduos de um determinado grupo (cf. "covariâncias genotípicas"). Os passos para essa dedução são os seguintes:

Quanto aos dois primeiros passos, resultam directamente da teoria estatística da ANOVA. O sistema de equações é construído da seguinte forma: primeiro, a soma das variâncias calculadas em ii totaliza sempre V_A + V_D + E₁ + E₂; segundo, uma ou mais das variâncias, à excepção da variância dentro de famílias, corresponde a uma das fórmulas teóricas de covariância genotípica entre os membros de cada família (a covariância entre irmãos, entre meios-irmãos, etc.); terceiro, a variância dentro de famílias obtém-se subtraindo ao total (V_A + V_D + E₁ + E₂) a soma de todas as outras variâncias, cada uma das quais correspondente a uma em função das parcelas da variância total.

A escolha do melhor design experimental depende do compromisso entre vantagens e desvantagens de cada um: se por um lado um maior número de fontes de variação recolhe maior quantidade de informação para o cálculo das componentes da variância fenotípica, por outro implica uma maior complexidade da experiência, mais espaço e labor, e até por causa da biologia da planta pode nem ser aplicável.

Este design refere-se a cruzamentos biparentais, isto é, à formação de "casais" distintos e análise das suas descendências. Numa amostra de 2K indivíduos produzem-se K cruzamentos; fazendo uma amostragem de M descendentes por cruzamento, obtém-se um total de KM observações que entram na tabela ANOVA da seguinte maneira (unifactorial não hierarquizada):

A s²_K é também uma covariância entre irmãos, ou seja

em que E₂ refere-se à variância ambiental entre famílias, deixando como resto

A inclusão do termo E₂ na covariância entre irmãos reflecte o uso comum de definir os talhões por cruzamentos; evidentemente, se as descendências de cada cruzamento forem repartidas aleatoriamente pelos talhões, E₂ deverá ser nulo.

Este design é relativamente fácil mas a informação recolhida insuficiente, porque para a determinação de quatro variáveis têm-se somente duas equações. Se a E₂ não for significativa (ou, como referido, o design implicar que é nula), tem-se então, com uma estimativa separada da E₁ (por exemplo pelas variâncias entre clones propagados vegetativamente, asssumindo que a COV_GE = 0):

s²_W – s²_K = ½V_D + E₁, donde se obtém V_D = 2(s²_W – s²_K – E₁) e V_A = 2s²_K – ½V_D.

A heritabilidade será dada pelo quociente entre o V_A obtido e o somatório de V_A, V_D e E₁ (com E₂ = 0).

A estimativa de V_A pode ser afinada estatisticamente (máxima verosimilhança) juntando-se-lhe os dados do cálculo independente das correlações progenitor-descendência (expectativa ½V_A). Este procedimento de optimização deve ser utilizado na medida do possível em qualquer um dos designs ANOVA.

Na impossibilidade de anular E₂, deve expandir-se o design experimental levando este factor em conta, isto é, repartindo os M descendentes de cada cruzamento por talhões representativos das variações ambientais causadoras de E₂. Fica-se assim com uma ANOVA bifactorial com replicação, e uma oportunidade de incluir uma componente de interacção entre os dois factores de variação (K e E) como estimativa da COV_GE. O mesmo também se aplica aos restantes designs ANOVA.

Existem K indivíduos que fornecem o pólen (os machos), cada um polinizando L flores femininas, pelo que há KL cruzamentos distintos (KL genótipos femininos), para cada um observando-se M descendentes (N = KLM). Tabela ANOVA (unifactorial hierarquizada):

em que o termo SS*²X se refere ao cálculo do quadrado das somas por macho, agrupando as L fêmeas numa só coluna, enquanto o termo SS²X indica o cálculo dos quadrados das somas por fêmea.

s²_K é a covariância entre meios-irmãos, donde resulta s²_K = ¼V_A

Tal como nos BiPs, a covariância dentro de cada família é entre irmãos, pelo que subtraindo-a à variância total fica-se com s²_W = V_A + V_D + E₁ + E₂ – (½V_A + ¼V_D + E₂)

donde s²_W = ½V_A + ¾V_D + E₁

restando s²_L = ¼V_A + ¼V_D + E₂

Assim, desde que se garanta E₂ = 0, obtém-se

Novamente, a heritabilidade é dada pelo quociente entre V_A e a soma V_A + V_D + E₁. Falconer e MacKay notam, nestes resultados para E₂ = 0, que na possibilidade de s²_L ≅ s²_K então V_D = 0; nesse caso, aquelas duas variâncias são ambas estimativas independentes de ¼V_A, podendo ser utilizadas em conjunto, para além de outros testes que se façam (cf. "BiPs"), para optimizar a estimativa da heritabilidade.

Todos os indivíduos se cruzam com todos, excepto consigo mesmos. Considerando uma série de K indivíduos que fornecem o pólen, e outra série de L indivíduos cujas flores são polinizadas, há que assegurar-se que cada um destes L indivíduos seja polinizado separadamente por cada um dos K pólens. Igualmente com uma dimensão N = KLM de total de observações na descendência, pode imaginar-se este tipo de cruzamento de duas maneiras: cada uma das L plantas que são polinizadas têm de dispor de K flores femininas, para receberem pólen de indivíduos diferentes; alternativamente, cada uma das L plantas a serem polinizadas é propagada vegetativamente K vezes. Tabela ANOVA (bifactorial com replicação):

s²_L e s²_K são covariâncias entre meios-irmãos, pelo que

considerando de novo

resta portanto

Têm-se duas estimativas independentes de V_A, ou então a possibilidade de detectar efeitos maternos (comparando s²_L e s²_K) e, se E₂ for nulo (ou fazendo a necessária estimativa, ficando ANOVA trifactorial) uma estimativa directa de V_D, donde a de E₁.

Muitas plantas têm ciclos de vida tão longos que a expectativa de uma análise entre duas gerações acarreta uma espera de vários anos, nem sempre comportável, tanto na análise como na selecção. No entanto, a observação repetida do fenótipo de cada indivíduo em ocorrências independentes (por exemplo o peso total dos frutos em cada colheita, ou a taxa de crescimento anual do tronco, etc.) permite eventualmente deduzir um padrão característico de indivíduo para indivíduo, o qual se deve em parte às respectivas características genotípicas.

O esquema mais comum consiste numa ANOVA unifactorial não hierarquizada, com as seguintes componentes (L observações de K indivíduos):

A s²_W é em princípio exclusivamente ambiental, mas corresponde (segundo Falconer e MacKay) apenas à variação entre repetições, que toma o nome de variância ambiental temporária V_{E t}. Isto é, se as medições foram feitas em anos sucessivos, a V_{E t} corresponde à variação fenotípica que resultou de flutuações ambientais no conjunto dos anos de observação. Este factor distingue-se de uma variância ambiental permanente V_{E p}, que é toda a componente ambiental residual, isto é, não atribuível às flutuações entre repetições.

Deste modo, fica-se com

e

em que V_G é a variância de valores genotípicos, mas inseparável, por este método, da V_{E p}. Ao quociente entre V_G + V_{E p} e a variância total V_G + V_{E p} + V_{E t} dá-se o nome de repetibilidade, cujo interesse é o de fornecer uma estimativa por excesso da heritabilidade (ficam por separar, não só a V_{E p} como também as componentes não-aditivas da V_G).

Alternativamente, pode escolher-se (com os mesmos dados) uma tabela ANOVA bifactorial sem replicação:

Esta tabela permite calcular a V_{E t} ortogonalmente à V_G, deixando como resíduo a V_{E p}:

O quociente entre V_G e V_P (neste caso, a soma V_G + V_{E t} + V_{E p}) tem o nome de heritabilidade em sentido lato (para distinguir da definição de heritabilidade V_A/V_P que, neste contexto, passa a apelidar-se heritabilidade em sentido estrito) ou grau de determinação genética, e funciona também como majorante, aperfeiçoado, da h².

Regressão

O cálculo de regressões das descendências nos progenitores é um auxiliar importante para a determinação da heritabilidade, tanto na análise dos designs ANOVA como em F₂ dos cruzamentos entre linhas puras. No caso dos designs ANOVA, requer o cuidado suplementar de fazer o registo das observações nos progenitores; no caso das F₂, como já referido, confere um suplemento ou até uma alternativa aos backcrosses para estimar a V_A.

A regressão dos valores fenotípicos da descendência (Y) nos dos respectivos progenitores (X) aplica a fórmula COV_XY/V_X, em que a COV_XY/V_X, calculada a partir dos dados, corresponde directamente à covariância genotípica entre progenitores e descendência para a característica, utilizando-se a fórmula genérica rV_A + uV_D; a V_X é a variância fenotípica dos progenitores, pelo que, quando u = 0, se deduz

O caso mais comum é a regressão da descendência num dos progenitores, para a qual se tem r = ½ e por isso h² = 2b_YX; se possível, deve fazer-se a comparação com ambos os progenitores separadamente, e caso haja uma estimativa mais elevada com o progenitor feminino tem-se uma indicação sobre a existência de efeitos maternos (que são ambientais, embora se correlacionem com a componente aditiva). Caso se utilize o valor fenotípico médio de cada par de progenitores para o respectivo valor de X, e dado que se continua a ter r = ½, então b_YX = (½V_A)/(½V_P) = h².

A heritabilidade já não é estimável directamente caso a descendência resultasse de selfing dos progenitores, porque a covariância é V_A + ½V_D, pelo que terá talvez de evitar este procedimento para o estudo das regressões; mas o b_YX resultante permite mesmo assim ter um termo de comparação com as estimativas de V_A e V_D por outros métodos.